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IRS2
Du 01 janvier 2019 au 30 juin 2019, à Nantes, France

Subject : Gene therapy using AAV-derived viral vectors: Characterization of pre-existing cellular anti-AAV immunity and its impact on gene transfer.

One of the major hurdles to gene therapy strategies using recombinant Adeno-Associated Virus vectors (rAAV) is the pre-existing anti-AAV immunity. This response can be mediated by pre-existing anti-viral antibodies and/or memory T cell responses in humans. Understanding the impact of pre-existing capsid-specific CD8+ T lymphocytes on the efficiency and safety of gene transfer is critical from a clinical perspective. Nevertheless, this immune response remains elusive because the detection and subsequent evaluation of capsid specific T cells is still a challenge with currently available assays, due to their scarcity.

We have previously developed a methodology to detect and isolate human AAV-specific CD8+ T cells through tetramer-associated magnetic enrichment (TAME). We have subsequently generated their corresponding T cell lines. Our objective is to characterize these cells in vitro and in vivo. This technique allows us to isolate T cells according to their antigenic recognition; another isolation strategy has been described in the literature, the cytokine capture assay. With this other technique, T cell isolation is based on their functionality via cytokine secretion (e.g. IFNƴ) in response to an antigenic peptide (in our case, AAV capsid peptides).

The main objective of the internship will be to perform a capsid-specific T cell frequency and phenotype comparison (by flow cytometry) using these 2 different methods, in order to evaluate the relevance of the two techniques and to determine if the two isolated populations are similar. A functionality study will be also performed, based on a cytotoxic assay. During the internship, the student will also have the opportunity to be involved in the project and to use a variety of techniques and assays including cellular assays (e.g. cytotoxic assays, ELISpot), flow cytometry (e.g. multiparametric phenotyping), cytokine assays (e.g. cytokine capture and detection assay) and molecular assays (e.g. qPCR and RT-PCR).

Contact

Rebecca Xicluna,

rebecca.xicluna@univ-nantes
Tél. : + 33 (0)2.28.08.04.20
Team : Immunologie du transfert de gène à l’aide de vecteurs AAV

IRS2

Offre de stage Master 2 – Innovation en Vectorologie

2018/2019, à Nantes, France

Résumé du projet proposé :

Les vecteurs viraux dérivés du virus AAV (adeno-associated virus) sont des outils de choix pour le transfert de gène in vivo. Le développement de ces vecteurs a permis le succès de plusieurs essais cliniques de thérapie génique. Cependant, de nombreux défis restent à relever afin d’étendre l’utilisation de ces vecteurs au plus grand nombre d’applications thérapeutiques, en particulier la fabrication de vecteurs de grade pharmaceutique à grande échelle. Le système de production en cellules d’insecte par infection avec des baculovirus recombinants peut répondre à ce défi (Urabe et al., 2002). Cependant, la biologie de l’AAV, virus d’origine mammifère, est peu connue dans les cellules d’insecte d’où l’apparition de problèmes tels que la présence de particules vides (ne contenant pas le gène thérapeutique) dans les lots de vecteurs. L’AAV est un virus qui nécessite la co-infection avec un virus « helper » tel que l’adénovirus pour se répliquer en cellule de mammifère. Malgré un recul de 16 ans sur la technologie Sf9/baculovirus, ces fonctions auxiliaires sont inconnues en cellule d’insecte. Le but de ce stage est donc d’identifier les protéines associées aux protéines de Rep de l’AAV, protéines jouant un rôle central dans la réplication et l’encapsidation du génome viral. Nous anticipons qu’inhiber ou activer l’expression de ces protéines pourraient améliorer le rendement de production des vecteurs AAV et leur qualité. Les techniques nécessaires pour la réalisation de ce projet seront :

  • biologie moléculaire : clonage, préparation de plasmide
  • culture cellulaire : transfection, infection de cellules d’insecte
  • caractérisation des complexes protéiques : coimmunoprécipitation, spectrométrie de masse
  • les méthodes nécessaires à l’étude de la réplication et l’encapsidation du génome viral : qPCR, ELISA, électrophorèse en gel natif

Contact :

Magalie PENAUD-BUDLOO magalie.penaud-budloo@univ-nantes.fr

Tel : 02.28.08.04.44

Equipe : « Innovation en vectorology »